Resume: Teknik Aseptis

Resume

Teknik Aseptis
By: Sari Rahmah Handayani

Kondisi aseptis merupakan kondisi bebas dari mikroorganisme seperti fungi, bakteri, yeast, virus, mikoplasma, dan lain sebagainya. Kondisi aseptis atau steril harus dipenuhi oleh eksplan, peralatan, dan proses pengerjaan kultur. Pertumbuhan mikroorganisme tersebut umumnya lebih cepat dibandingkan pertumbuhan jaringan tumbuhan, sehingga dapat menghambat pertumbuhan eksplan. Hambatan dalam pelaksanaan Kultur Jaringan Tumbuhan adalah kontaminasi yang dapat terjadi selama prosedur maupun tahapan pengerjaan maupun selama pemiliharaan. Kontaminasi mikrobia mengakibatkan berkurangnya hara, menghasilkan senyawa toksik, dan memakan eksplan. Mikrobia terdapat dalam jumlah yang banyak. Mikrobia bereproduksi dengan cepat dan mempunyai aktivitas metabolisme yang tinggi. Sterilisasi dalam pelaksanaan Kultur Jaringan Tumbuhan terdiri dari sterilisasi ruang kerja, medium dan alat-alat, serta eksplan.

Seluruh bagian ruang kerja harus steril dan bersih. Sterilisasi ruang kerja dapat dilakukan dengan menggunakan disinfektan dan UV. Radiasi UV tidak berbahaya bagi manusia karena tidak mengion, namun sinar ultra violet dapat mengubah DNA dengan pembentukan dimer antara dua basa timin pada satu rantai DNA. Penetrasi sinar UV pada superfisial jaringan dapat melukai kulit dan retina serta dapat menghasilkan ozon, sehingga peneliti harus menunggu 15‒30 menit supaya ozon tidak terserap. Di dalam ruang kerja, peneliti harus menggunakkan jas lab, masker, penutup kepala, memakai sarung tangan dari karet, dan mencuci tangan dengan antiseptik. Alat yang digunakan untuk menciptakan kondisi steril yaitu LAF dan entkas.

Prinsip kerja Laminar Air Flow yaitu dengan hembusan udara yang sudah difilter. Udara yang dihisap oleh blower dihembuskan melalui HEPA (High Efficiency Particulate Air) filter dengan porositas 0,22 μm. Spora-spora jamur dan bakteri akan tertahan, sehingga udara yang berhembus keluar sudah steril. LAF biasanya dilengkapi dengan UV. Sebelum mulai bekerja, permukaan meja kerja LAF disemprot dan dilap dengan kain yang telah dibasahi alkohol 70%. Semua alat dimasukkan ruang kerja. Alat-alat dan medium harus sudah steril baik permukaan maupun bagian dalamnya. Permukaan botol kultur yang berisi media disemprot atau dilap dengan alkohol 70%. Pada LAF yang dilengkapi dengan UV, sebelum bekerja lampu UV dinyalakan selama 30-60 menit untuk mematikan kontaminan pada permukaan ruang kerja.

LAF
indiamart.com

Entkas berwujud seperti kotak yang terbuat dari bahan kaca, plywood, papan kayu atau yang lebih sederhana misalnya dari kardus yang didalamnya dilapisi aluminum foil. Sebelum mulai bekerja, dinding entkas dibersihkan dengan kain yang dibasahi alkohol 70%. Ruang kerja didalam entkas disterilisasi dengan formalin tablet yang ditaruh didalam cawan porselin kecil dan diletakkan disudut-sudut ruangan. Uap formalin ini dapat mensterilkan udara yang terdapat didalam entkas. Alat-alat dan botol kultur yang berisi media disemprot permukaannya dengan alkohol 70%, kemudian dimasukkan kedalam entkas dan dibiarkan 30 menit. Pada entkas juga dapat ditambahkan lampu UV. Seluruh dinding luar entkas harus ditutup dengan aluminum foil, hal ini diperlukan untuk menghindari mata dan kulit dari bahaya radiasi UV.

Sterilisasi media dan alat menggunakan autoklaf (121º C, 15-40 menit, 15-17 psi). Sterilisasi medium kultur dengan menggunakan autoclave mempunyai banyak kelemahan, antara lain: sukrosa akan terurai menjadi fruktosa dan glukosa; terbentuknya caramel gula (coklat) merupakan racun pada media; perubahan pH; pengendapan garam-garam; dan depolimerisasi agar. Beberapa komponen medium ada yang tidak stabil kalau kena panas yang tinggi, misalnya GA3, Ca-panthothenate, dan Thiamin-HCl harus disterilisasi dengan ultra filtrasi (millipore filter) pada suhu ruangan (25°C). Sterilisasi alat-alat dapat dilakukan dengan mencuci bersih dan dibungkus dengan kertas payung yang berwarna coklat. Tidak dianjurkan untuk memakai aluminium foil karena uap air tidak dapat masuk. Sterilisasi untuk botol dilakukan dengan cara mencuci, kemudian ditutup dengan aluminium foil, dan ditutup dengan karet, kain, atau plastik. Penutupan botol tidak boleh terlalu rapat supaya tidak ada perbedaan tekanan. Perbedaan tekanan tersebut dapat menyebabkan botol pecah.

Pada sterilisasi eksplan harus memperhatikan letak dan ukuran eksplan. Bahan yang digunakan dalam sterilisasi diantaranya alkohol, calcium dan sodium hypochlorite, mercuric chlorite, dan sebagainya. Bahan tersebut dapat bersifat racun bagi eksplan, sehingga harus memperhatikan konsentrasi dan dilakukan pencucian. Terkadang ditambahkan agen pembasah (Triton x, Tween 20, Tween 80) untuk menambah tegangan permukaan atau menggunakkan pompa vakum untuk meningkatkan penetrasi pada permukaan sehingga lebih efisien. Tahap pra sterilisasi dilakukan pencucian dengan sabun atau deterjen. Setelah itu, dibilas dengan air mengalir selama 15‒30 menit untuk memecah koloni agar peka terhadap bahan pensteril. Terkadang digunakan lebih dari satu bahan pensteril. Untuk eksplan yang berdaging (umbi kentang, wortel), eksplan yang tertutup sarung daun (pucuk tebu), dan biji muda yang masih terdapat didalam buah (anggrek) dapat disterilisasi dengan merendam didalam alkohol beberapa saat, kemudian dilewatkan diatas nyala api dan dibiarkan sampai nyala api padam. Hal tersebut cukup efektif untuk membawa kultur bebas dari kontaminan.

Sumber:

Elisa UGM. 2019. Medium Kultur Jaringan Tumbuhan. https://elisa.ugm.ac.id/.  Diakses pada 2 September 2019.

Mastuti, R. 2017. Dasar-dasar Kultur Jaringan Tumbuhan. UB Press. Malang, Hal.10.

Pierik, R. L. M. 1997. Vitro Culture of Higher Plants. Springer Science Business Media. Wageningen, P:9.

Sathyanarayana, S. N. and D. B. Verghese. 2007. Plant Tissue Culture: Practices and New Experimental Protocols. International Publishing House. New Delhi, P:20.